Để có thể tạo ảnh hiển vi huỳnh quang, mẫu vật cần phải là mẫu có khả năng phát huỳnh quang. Một số mẫu tế bào thực vật có khả năng phát huỳnh quang tự nhiên và do đó không cần nhuộm. Tuy nhiên, có rất nhiều mẫu vật không có khả năng phát quang tự nhiên, và khi đó mẫu cần phải nhuộm với một số chất nhuộm huỳnh quang. Các chất này sẽ bao phủ các cấu trúc tế vi của mẫu và phát ra ánh sáng huỳnh quang khi được kích thích và tạo ra ảnh huỳnh quang.[6]